β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法

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1.常規(guī)方法

（1）.微生物法：

[原理]以一種對青霉素高度敏感的細菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗時如果被測細菌株產(chǎn)生青霉素酶，破壞了青霉素，則此高度敏感菌株即可生長，否則，指示劑則被抑制。

[方法]以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內(nèi)。然后將被測菌與產(chǎn)青霉素酶陽性及陰性對照菌株，按下圖接種劃線，在瓊脂培養(yǎng)基中央放置一含青霉素G（1單位）紙片。放置35℃培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。

[結(jié)果判斷]如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶，則沿著被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現(xiàn)凹痕。

（2）.碘量法^[3]

[原理]β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競爭游離碘，破壞了碘和淀粉的蘭色復合物，使蘭色變?yōu)闊o色。

[方法]

①將0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml于一小試管中。

②將培養(yǎng)18-24小時的細菌在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液（10^9/ml）。

③在37℃水浴中放置30分鐘，不時搖動，使酶能破壞青霉素。

④加入1%可溶性淀粉溶液0.5ml，搖勻。

⑤加入碘液0.02 ml。

⑥在37℃水浴中放置10分鐘，觀察結(jié)果。

[結(jié)果]在10分鐘內(nèi)能使蘭色*消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽性，不消退者為陰性。

[注意事項]

①由于青霉素很容易分解，因而用于實驗的青霉素應新鮮配制。

②淀粉也新鮮配制，在100ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉，放到開水中水浴直到淀粉溶解。

③實驗應按照步驟操作，如果碘加得過早，酶反應就會停止，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

④每次試驗用陽性和陰性對照。

（3）.紙片酸度定量法^[3]

[原理]β-內(nèi)酰胺酶能破壞青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。

[方法]

①將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。

②讓濾紙吸足青霉素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無緩沖劑的結(jié)晶青霉素）。

③用接種環(huán)把10-20個菌落涂到濾紙上，

④蓋好平皿后，將濾紙片在37℃孵育30分鐘，觀察結(jié)果。

[結(jié)果] 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色，一般在10分鐘內(nèi)即能看到。

（4）.產(chǎn)色頭胞菌素法^[4]

[原理]產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色，以此來測定細菌的產(chǎn)酶情況。

[方法]將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置于干凈的平皿內(nèi)，用無菌的牙簽或接種環(huán)挑取細菌菌落涂于紙片上，觀察紙片有無顏色變化。

[結(jié)果]紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，如顏色不變，表示細菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。

檢測β-內(nèi)酰胺酶方法中，生物學方法是古老的方法，由于特異性差、靈敏度低，現(xiàn)在基本上很少被采用，頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結(jié)果可靠。紙片酸度定量法一般用于檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用于檢測淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。

對于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測定β-內(nèi)酰胺酶比做藥敏試驗能更快地得到臨床需要的結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青霉素的敏感試驗結(jié)果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內(nèi)酰胺酶，因其結(jié)果常常不能預測這類細菌對臨床常用來治療β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的敏感性^[5]。