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飼料中三聚氰胺的檢測(cè)方案
檢測(cè)原理：
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過(guò)均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測(cè)定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開(kāi)始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過(guò)程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒(méi)有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。再用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。
需要準(zhǔn)備的材料：
1、蒸餾水或去離子水
2、可吸取50ul和100ul的移液器及吸頭
3、4000轉(zhuǎn)離心機(jī)
4、吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?/font>
5、450nm的酶標(biāo)儀
6、計(jì)時(shí)器
7、20mM PBS：需自行配制
8、清洗液：需自行配制
試劑配制：
1、20mM PBS： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml
2、清 洗 液： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml.+0.5ml 土溫20
樣品的前處理： 飼料（稀釋倍數(shù)：20）
1、稱(chēng)1g飼料樣品，加入4ml甲醇；
2、震蕩1min，加入0.1g氯化鈉；
3、4000轉(zhuǎn)離心5min；
4、取上清液0.2ml加入到0.8ml的20mMPBS中，混勻；
5、取150ul測(cè)定。
測(cè)定過(guò)程：
1、將所有試劑及樣品回升至室溫20-28℃，但不要放置超過(guò)24小時(shí)；
2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條固定在微孔板架上，未使用的孔條與干燥劑一同放入密封袋中保存；
3、吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)品、樣品到對(duì)應(yīng)微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。加入
50ul三聚氰胺酶標(biāo)記物到每個(gè)小孔中；
4、輕輕搖板60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘；
5、將微孔中的溶液倒入水槽中，用清洗液*充滿(mǎn)微孔，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板；
6、zui后一次清洗完后，倒掉孔中溶液，然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干；
7、每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液；
8、20-28攝氏度下，孵育30分鐘；
9、每個(gè)微孔中加入100ul停止液；
10、450nm下讀板
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