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公司動(dòng)態(tài)
單分子測(cè)序靈敏檢測(cè)5-hmC
點(diǎn)擊次數(shù)：3153 發(fā)布時(shí)間：2011-11-24
單分子測(cè)序靈敏檢測(cè)5-hmC
www.biomart.cn/runwell/index.htm
對(duì)于“神秘”的5-hmC，目前還沒(méi)有一種測(cè)序方法能準(zhǔn)確判定它在基因組中的位置。為此，美國(guó)芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，利用第三代單分子SMRT測(cè)序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)高通量檢測(cè)5-hmC。通過(guò)聚合酶動(dòng)力學(xué)帶來(lái)的寶貴信息，研究人員可直接檢測(cè)DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。
甲基化研究如今開(kāi)展得如火如荼。除了人們熟知的5-mC，很多研究人員也將目光轉(zhuǎn)向了另一種DNA修飾——5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。5-hmC是5-mC的羥基化形式，1952年在噬菌體DNA中發(fā)現(xiàn)。幾十年來(lái)，羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對(duì)于噬菌體DNA的保護(hù)作用。直到zui近，人們發(fā)現(xiàn)它與多個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞功能有關(guān)，包括胚胎干細(xì)胞發(fā)育、正常的骨髓細(xì)胞生成和受精卵發(fā)育。
若想深入了解5-hmC的生物學(xué)功能，必須開(kāi)發(fā)出一種靈敏的測(cè)序方法，以揭示它在基因組中的位置。而現(xiàn)有的測(cè)序方法，如亞硫酸氫鹽測(cè)序，無(wú)法區(qū)分5-mC和5-hmC。為此，美國(guó)芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，利用第三代單分子測(cè)序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)高通量檢測(cè)5-hmC。該研究成果于11月20日發(fā)表在《Nature Methods》在線(xiàn)版上。
Pacific Biosciences公司開(kāi)發(fā)的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）DNA測(cè)序是一種第三代的測(cè)序技術(shù)，它利用單個(gè)DNA聚合酶分子來(lái)開(kāi)展DNA合成，并監(jiān)控核苷酸的不斷摻入。核苷酸摻入的實(shí)時(shí)記錄，不僅產(chǎn)生了序列讀取，還帶來(lái)了關(guān)于聚合酶動(dòng)力學(xué)的寶貴信息。通過(guò)這些信息，研究人員能鑒別DNA堿基的修飾。
一般來(lái)說(shuō)，聚合酶在修飾堿基周?chē)乃俾室任葱揎桪NA慢。通過(guò)比較每個(gè)模板位點(diǎn)的摻入時(shí)間、脈沖間持續(xù)時(shí)間（IPD），可定量比較這一差異。利用這一方法，研究人員可直接檢測(cè)DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶動(dòng)力學(xué)的測(cè)定是SMRT測(cè)序的內(nèi)在組成，不會(huì)對(duì)DNA一級(jí)序列的測(cè)定有任何不良影響。
研究人員還對(duì)5-hmC進(jìn)行了選擇性化學(xué)標(biāo)記。首先利用β-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶為5-hmC引入疊氮修飾，之后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）反應(yīng)安裝一個(gè)生物素標(biāo)簽。通過(guò)這種方法，研究人員富集了基因組中的5-hmC，減少所需的測(cè)序量。此外，5-hmC上的大體積標(biāo)簽在SMRT測(cè)序中產(chǎn)生了更大的動(dòng)力學(xué)信號(hào)，以便在較低覆蓋度時(shí)更自信地修飾堿基。
為了檢驗(yàn)這種方法的可行性，研究人員檢測(cè)了小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）中的5-hmC。在選擇性標(biāo)記和富集之后，他們制備了SMRTbell DNA文庫(kù)，用于鳥(niǎo)槍法SMRT測(cè)序，并分析動(dòng)力學(xué)信號(hào)。他們檢測(cè)到清晰的HS-N3-5-gmC信號(hào)。由于動(dòng)力學(xué)信號(hào)的大幅增加，在單分子讀取中可輕松5-hmC的位點(diǎn)，而無(wú)需與未修飾的對(duì)照樣品進(jìn)行比較。
作者認(rèn)為，這種技術(shù)將是研究5-hmC生物學(xué)功能的有力方法。