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R&D systems公司 ELISA 酶聯(lián)吸附免疫法Q&A

問(wèn)：我的Quantikine試劑盒中的RD1測(cè)試稀釋劑看上去有沉淀物，可以用嗎？

答：有些RD1測(cè)試稀釋劑的確有不同程度的沉淀物。在這種情況下，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)步驟手冊(cè)中已做紀(jì)錄。

問(wèn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線為什么要采用4-pl擬合？

答：R&D Systems在研發(fā)和質(zhì)控我們絕大多數(shù)的Quantikine ELISA試劑盒時(shí)，采用4-相參數(shù)的曲線擬合（又名為4-pl或sigmoidal曲線擬合）。一般來(lái)說(shuō)，它比log-log和直線有更好的曲線擬合。 如果數(shù)據(jù)分析不可用4-pl的話，log-log是下一個(gè)的選擇。

問(wèn)：試驗(yàn)步驟中說(shuō)要用500 rpm，我的搖床達(dá)不到。這個(gè)速度是正確的嗎？

答：500 rpm使用的是0.12英寸的震蕩軌道。如果你的震蕩器用更大的震蕩軌道，500 rpm的確是過(guò)快了。在這種情況下，你應(yīng)根據(jù)R&D Systems的建議重新調(diào)整震蕩速度。你可拿一個(gè)多余的96孔微孔板，加入洗液，洗液的量與實(shí)驗(yàn)時(shí)孔中的溶液量一致；封板后，調(diào)整震蕩器的速度，直到液 體在孔的上部劇烈旋轉(zhuǎn)但不濺到封膜上或產(chǎn)生泡沫為止。

問(wèn)：我有太大變異系數(shù)（CV）的問(wèn)題，是怎么回事？

答：zui大但不是*的兩個(gè)原因，可能是移液誤差和清洗方式。

問(wèn)：Quantikine ELISA試劑為什么需要做稀釋?zhuān)?/strong>

答：主要有兩個(gè)原因：一，在絕大多數(shù)的樣本中細(xì)胞因子的含量非常高，如不經(jīng)稀釋?zhuān)x數(shù)將高于標(biāo)準(zhǔn)曲線；二，也是zui普遍的原因我們建議做稀釋?zhuān)菍颖局械母蓴_或基質(zhì)效應(yīng)稀釋掉。

問(wèn)：我是否可以在任何時(shí)間過(guò)長(zhǎng)步驟停止Quantikine試驗(yàn)、延長(zhǎng)溫育時(shí)間、或提高溫育的溫度？

答：R&D System不建議對(duì)任何Quantikine ELISA延長(zhǎng)溫育時(shí)間。而且，當(dāng)實(shí)驗(yàn)步驟改變了，我們無(wú)法保證Quantikine ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。R&D System做“整個(gè)試劑盒的質(zhì)量控制"，就是說(shuō)我們無(wú)法支持改變過(guò)的實(shí)驗(yàn)步驟，因?yàn)樗鼈兾唇?jīng)質(zhì)量控制。延長(zhǎng)溫育時(shí)間、或提高溫育溫度以縮短溫育時(shí)間會(huì)提 高實(shí)驗(yàn)的本底（又名空白或零標(biāo)準(zhǔn)）。這樣一來(lái)，樣本和標(biāo)準(zhǔn)中的低量細(xì)胞因子會(huì)測(cè)不到，因?yàn)樵龈吡说谋镜仔盘?hào)將從所有孔中的數(shù)值中差減。

問(wèn)：我用了DuoSet ELISA開(kāi)發(fā)系統(tǒng)，但幾乎就沒(méi)有顏色產(chǎn)生。那些步驟可能出了問(wèn)題？

答：很多方面都會(huì)影響到顏色的產(chǎn)生。比如：
1) BSA的干擾。選擇不含脂肪酸的ELIS*別的BSA很重要，可以降低球蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。R&D Systems建議使用Serological Proteins的BSA（目錄#82-045）。
2) 非室溫下的試劑在使用時(shí)會(huì)抑制信號(hào)；如果室溫過(guò)低，信號(hào)也會(huì)被抑制。
3) 如果使用了未表明為“高結(jié)合性ELISA"的微孔板，捕獲抗體同微孔板的結(jié)合就不牢固，從而導(dǎo)致測(cè)試的顏色產(chǎn)生過(guò)低。
4) 任何試劑，如果配制出錯(cuò)、儲(chǔ)藏不當(dāng)、或已過(guò)期，都將出現(xiàn)這一問(wèn)題。
5) 讀板時(shí)使用的波長(zhǎng)同低物的波長(zhǎng)不一致。

問(wèn)：我是否可以使用你們的抗體配對(duì)ELISA中的抗體，但用另一家公司的蛋白為標(biāo)準(zhǔn)？

答：若使用一家公司的抗體而用另一家公司的標(biāo)準(zhǔn)的帶來(lái)問(wèn)題是它們會(huì)有不同的免疫活性（或不同的抗體與重組蛋白的結(jié)合力）。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是因?yàn)?作為標(biāo)準(zhǔn)的重組蛋白同作為抗體免疫原的重組蛋白在蛋白序列或折疊中會(huì)有所不同，如果蛋白序列或折疊的不同發(fā)生在抗體結(jié)合部位，就會(huì)引起抗體對(duì)重組蛋白標(biāo)準(zhǔn) 的不識(shí)別或識(shí)別很差。