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技術(shù)文章
碘克沙醇梯度溶液分離細(xì)胞核
點(diǎn)擊次數(shù)：4474 發(fā)布時(shí)間：2011-1-18
碘克沙醇梯度溶液分離細(xì)胞核
用碘克沙醇梯度溶液從哺乳動(dòng)物肝臟中分離細(xì)胞核 www.elisa17.com
試劑和器材：
1. OptiPrepTM（600g碘克沙醇，ρ=1.32g/ml）；
2. OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8；
3. 勻漿介質(zhì)（HM）：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質(zhì)中加入蛋白酶抑制劑
4. 高轉(zhuǎn)矩橋式電動(dòng)機(jī)（半導(dǎo)體開關(guān)控制）；
5. Potter-Elvehjem勻漿器，20—40ml，孔隙約0.07mm；
6. 高速離心機(jī)，帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉(zhuǎn)子；
7. 注射器，帶金屬套管針（內(nèi)徑約0.8mm）；
8. 尼龍濾網(wǎng)；
1. OptiPrepTM（600g碘克沙醇，ρ=1.32g/ml）；
2. OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8；
3. 勻漿介質(zhì)（HM）：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質(zhì)中加入蛋白酶抑制劑
4. 高轉(zhuǎn)矩橋式電動(dòng)機(jī)（半導(dǎo)體開關(guān)控制）；
5. Potter-Elvehjem勻漿器，20—40ml，孔隙約0.07mm；
6. 高速離心機(jī)，帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉(zhuǎn)子；
7. 注射器，帶金屬套管針（內(nèi)徑約0.8mm）；
8. 尼龍濾網(wǎng)；
實(shí)驗(yàn)方法：
所有操作在0—4℃下進(jìn)行。
1. 制備500g/L碘克沙醇工作液：每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來(lái)稀釋；
2. 梯度溶液：用勻漿介質(zhì)（分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積）來(lái)稀釋500g/L碘克沙醇工作液以制備300g/L和350g/L的兩種碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。
3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊；
4. 將大約一半肝臟轉(zhuǎn)移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質(zhì)中，并用研杵研磨約8次，在約500r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)以破碎組織；
5. 對(duì)另一半肝臟切碎物重復(fù)以上操作；
6. 用尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾；
7. 通過(guò)與等體積的500g/L碘克沙醇工作液混合將勻漿液調(diào)整到250g/L碘克沙醇；
8. 將10—15ml勻漿液轉(zhuǎn)移到50ml管中，從300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下；
9. 在100000g下離心20min；
10. 細(xì)胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成帶，用注射器和金屬套管針吸取細(xì)胞核；
11. 用2倍體積的勻漿介質(zhì)稀釋懸液，在2000g下離心10min沉淀細(xì)胞核；
所有操作在0—4℃下進(jìn)行。
1. 制備500g/L碘克沙醇工作液：每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來(lái)稀釋；
2. 梯度溶液：用勻漿介質(zhì)（分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積）來(lái)稀釋500g/L碘克沙醇工作液以制備300g/L和350g/L的兩種碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。
3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊；
4. 將大約一半肝臟轉(zhuǎn)移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質(zhì)中，并用研杵研磨約8次，在約500r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)以破碎組織；
5. 對(duì)另一半肝臟切碎物重復(fù)以上操作；
6. 用尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾；
7. 通過(guò)與等體積的500g/L碘克沙醇工作液混合將勻漿液調(diào)整到250g/L碘克沙醇；
8. 將10—15ml勻漿液轉(zhuǎn)移到50ml管中，從300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下；
9. 在100000g下離心20min；
10. 細(xì)胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成帶，用注射器和金屬套管針吸取細(xì)胞核；
11. 用2倍體積的勻漿介質(zhì)稀釋懸液，在2000g下離心10min沉淀細(xì)胞核；