2023年8月22日，小干擾RNA(siRNA)降膽固醇藥物英克司蘭鈉注射液(樂(lè)可為®，Inclisiran)在遞交新藥申請(qǐng)9個(gè)月后獲NMPA批準(zhǔn)上市，為中國(guó)心血管疾病患者的長(zhǎng)期血脂管理帶來(lái)了前沿、依從性更高、更便捷的治療方案。
圖1. 英克司蘭的結(jié)構(gòu)[1]
英克司蘭是一種硫代修飾的寡核苷酸，將原有磷酸鍵中一個(gè)非橋連的氧原子用硫原子來(lái)置換。加入硫代磷酸酯鍵后寡核苷酸的穩(wěn)定性更好，能抵抗核酸酶的降解，因此有效地增加了寡核苷酸在細(xì)胞環(huán)境中的半衰期。雖然寡核苷酸的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)，但引入每個(gè)硫代磷酸酯鍵都會(huì)引入一個(gè)手性中心，因此含n個(gè)硫代修飾的寡核苷酸理論上存在 2? 種立體異構(gòu)體（如20-mer硫代寡核苷酸可能有上百萬(wàn)種異構(gòu)體）。
硫代寡核苷酸在液相色譜分析中常出現(xiàn)峰展寬現(xiàn)象，推測(cè)是由于理化性質(zhì)上存在的細(xì)微差異會(huì)導(dǎo)致非對(duì)映異構(gòu)體在色譜柱固定相上得到部分分離，所以硫代磷酸酯寡核苷酸的色譜峰比其天然（磷酸二酯）對(duì)應(yīng)物的色譜峰寬[2]。
在一些文獻(xiàn)中，我們也可以看到有一些規(guī)律[3]，圖2是相同的核酸序列，不同硫代個(gè)數(shù)的寡核苷酸樣品，在不同的離子對(duì)試劑條件下的峰形對(duì)比。對(duì)于弱的離子對(duì)試劑，非對(duì)映異構(gòu)體的分離更加明顯，而對(duì)于強(qiáng)的離子對(duì)系統(tǒng)則表現(xiàn)出抑制效果。因此學(xué)者假設(shè)非對(duì)映異構(gòu)體的分離是由于與C18固定相的疏水相互作用造成的，在使用親水性烷基胺的離子對(duì)反相液相色譜中，低濃度的ACN時(shí)更為明顯。強(qiáng)的離子對(duì)試劑需要高濃度的ACN來(lái)洗脫寡核苷酸，這導(dǎo)致非對(duì)映異構(gòu)體的分離減少。一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)同時(shí)也表明，PS寡核苷酸峰的寬度大于所有IP系統(tǒng)中的PO寡核苷酸。
圖2. 同一序列的21聚體寡核苷酸的分離（1-無(wú)硫代；2-一硫代；3-二硫代；4-四硫代；5-六硫代）在可比較的時(shí)間窗口（保留時(shí)間約10分鐘）內(nèi)實(shí)現(xiàn)寡核苷酸洗脫的峰形對(duì)比。
針對(duì)上述現(xiàn)象，本文開(kāi)發(fā)一種色譜條件能夠抑制硫代磷酸酯寡核苷酸非對(duì)映異構(gòu)體的峰展寬，同時(shí)使全長(zhǎng)硫代磷酸酯寡核苷酸（n）和其序列長(zhǎng)短異構(gòu)體（n+1和n-1）以及硫代不異構(gòu)體得到良好的分離，參見(jiàn)圖3和圖4。
圖3. AS鏈以及其失敗序列的單標(biāo)疊圖（深藍(lán)色：AS-1nt；；淺藍(lán)色：AS-1S；黑色：AS；綠色：AS+1nt）
圖4. SS鏈以及其失敗序列的單標(biāo)疊圖（深藍(lán)色：SS-1nt；；淺藍(lán)色：SS-1S；黑色：SS；綠色：SS+1nt）
采用Phenomenex的BioZen Oligo 是一種專為寡核苷酸分析設(shè)計(jì)的色譜柱，除了擁有了先進(jìn)的核-殼顆粒技術(shù)和有機(jī)硅膠雜化工藝，還引入了BioTi生物兼容性硬件，提高了色譜柱在低進(jìn)樣量分析時(shí)的靈敏度和穩(wěn)定性，特別是在處理生物樣品中寡核苷酸的表征和定量時(shí)。這種硬件改進(jìn)有助于改善回收率，對(duì)于治療性寡核苷酸藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制至關(guān)重要。
參考文獻(xiàn)
[1] Oligonucleotide Therapeutics — A New Class of Cholesterol-Lowering Drugs. N Engl J Med. 2017; 376(1):4-7.
[2] Z. Kadlecova, K. Kalíkova, E. Tesarova, M. Gilar, Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography:effect of ion-pairing system, J. Chromatogr. A 1676 (2022) 463201.
[3] Z. Kadlecov′a, K. Kalíkov′a, E. Tesaˇrov′a, M. Gilar, Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography: effect of ion-pairing system, J. Chromatogr. A 1676 (2022) 463201
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