GeoMx DSP 數(shù)字空間多組學(xué)分析系統(tǒng)

GeoMx DSP 數(shù)字空間多組學(xué)分析系統(tǒng)是美國(guó) NanoString 公司開發(fā)的一款基于探針雜交的檢測(cè)設(shè)備。它結(jié)合了組織影像分析和原位定量技術(shù)，可在保留組織形態(tài)學(xué)特征的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)組織切片中蛋白質(zhì)和 RNA 的空間原位表達(dá)量分析。

·       功能特點(diǎn)：

·       高分辨率空間信息獲取：能提供高分辨率的空間信息，讓研究人員可在復(fù)雜組織的細(xì)胞和亞細(xì)胞水平分析基因表達(dá)模式，有助于理解不同細(xì)胞類型之間的功能組織和相互作用。

·       多靶標(biāo)檢測(cè)：蛋白質(zhì)檢測(cè)可達(dá) 98 重，RNA 可實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組（約 20000 多種）檢測(cè)。也可在一張組織切片上同時(shí)檢測(cè)不超過 96 種蛋白質(zhì)的空間表達(dá)，或同時(shí)檢測(cè) 1000 種 RNA 分子。

·       多種樣本類型兼容：可檢測(cè)新鮮組織、石蠟包埋的 FFPE 以及組織芯片等多種樣本類型，對(duì)珍貴樣本可進(jìn)行非破壞性處理，且樣本可重復(fù)使用。

·       靈活的 ROI 選擇：具備五種不同的感興趣區(qū)域（ROI）圈選方式，ROI 大小為 10-800μm，同一張切片上可圈選的 ROI 數(shù)目不限，能從復(fù)雜組織中對(duì)細(xì)胞亞群或特定結(jié)構(gòu)進(jìn)行精準(zhǔn)分析。

·       技術(shù)原理：基于 NanoString 的 nCounter 條碼技術(shù)，依靠與光可裂解寡核苷酸標(biāo)簽偶聯(lián)的抗體或 RNA 探針進(jìn)行檢測(cè)。探針與載玻片上的 FFPE 組織切片雜交后，通過紫外線照射從組織的離散區(qū)域釋放寡核苷酸標(biāo)簽，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的 nCounter 分析對(duì)釋放的標(biāo)簽進(jìn)行定量，并將計(jì)數(shù)映射回組織位置，從而得分析物豐度的空間分辨數(shù)字圖譜。

·       分析流程：先應(yīng)用高復(fù)合寡核苷酸標(biāo)記的抗體混合物和形態(tài)學(xué)標(biāo)記物，然后使用可見光波長(zhǎng)的低復(fù)合成像來確定組織 “地貌”，選擇感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行高復(fù)合分析，接著在選定的 ROI 處通過紫外線釋放寡核苷酸標(biāo)簽，將釋放的標(biāo)簽存儲(chǔ)在微孔板中，進(jìn)行索引并與條碼雜交，最后使用 nSolver 高級(jí)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

·       應(yīng)用領(lǐng)域：廣泛應(yīng)用于病理空間原位大規(guī)?；虮磉_(dá)分析、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、癌癥干細(xì)胞、miRNA、疾病分子檢測(cè)等方面的研究，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)控Tumour的發(fā)生發(fā)展、藥物靶向代謝性疾病、基因的表達(dá)、病理空間原位信息等。

·       GeoMx DSP 數(shù)字空間多組學(xué)分析系統(tǒng)在Tumour研究等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，以下是一些具體案例：

·       解析結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制：研究人員選取 8 例 pT1 結(jié)直腸癌患者樣本，運(yùn)用 GeoMx DSP 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)等進(jìn)行分析。通過比較不同組織空間區(qū)域的基因表達(dá)譜，鑒定出上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的差異表達(dá)基因。發(fā)現(xiàn) CRC 發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞從促炎癥的 HLA-DR+CD204 - 亞群轉(zhuǎn)變?yōu)?HLA-DR-CD204 + 免疫抑制亞群，同時(shí) CD47/SIRPα 信號(hào)軸上調(diào)，確定了與進(jìn)展相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物及潛在Immunotherapy靶標(biāo) CD47-SIRPα。

·       研究食管鱗癌早期診斷生物標(biāo)志物：針對(duì)食管鱗癌，研究者利用 GeoMx DSP 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，對(duì) 11 名早期患者的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn) TAGLN2 在Tumour中表達(dá)顯著增加，而 CRNN 的表達(dá)水平隨病情進(jìn)展而降低。通路富集分析顯示細(xì)胞周期和 p53 信號(hào)通路的富集隨 ESCC 進(jìn)展而增加，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析表明成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在進(jìn)展過程中增多，證實(shí) TAGLN2 及 CRNN 可作為食管鱗狀癌前病變發(fā)展為 ESCC 的風(fēng)險(xiǎn)候選生物標(biāo)志物。

·       揭示肺腺癌進(jìn)展及空間異質(zhì)性：研究選取 10 例早期肺腺癌患者，采用 GeoMx DSP 空間蛋白組技術(shù)，并結(jié)合 WES、RNA-seq 等方法。發(fā)現(xiàn)從鱗狀到實(shí)體狀肺癌轉(zhuǎn)變由表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄重編程驅(qū)動(dòng)，與Tumour免疫浸潤(rùn)相關(guān)。利用該技術(shù)分析還發(fā)現(xiàn)實(shí)體Tumour中心免疫浸潤(rùn)水平低于外圍，外圍Tumour細(xì)胞 ki67 表達(dá)更高，核心區(qū)免疫細(xì)胞富集免疫抑制效應(yīng)因子 Tregs 標(biāo)記物，為肺腺癌Tumour內(nèi)空間異質(zhì)性提供了詳細(xì)分子圖譜。

·       分析小細(xì)胞肺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院Tumour醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)的團(tuán)隊(duì)，利用 GeoMx DSP 技術(shù)對(duì) 25 例小細(xì)胞肺癌患者的 79 個(gè)Tumour特異性區(qū)域進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析?；诨虮磉_(dá)模式將區(qū)域分為高、中、低異質(zhì)性表型，不同表型免疫特征差異顯著。研究還根據(jù)異質(zhì)性將患者分組，發(fā)現(xiàn)低復(fù)雜異質(zhì)性患者生存率更高，并開發(fā)了 ITHtyper 機(jī)器學(xué)習(xí)模型用于異質(zhì)性分類和風(fēng)險(xiǎn)分層，該模型在Immunotherapy隊(duì)列中具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。

·       剖析三陰性乳腺癌血管分子特征：為了解三陰性乳腺癌（TNBC）組織中Tumour內(nèi)皮細(xì)胞與正常鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的分子譜差異，研究人員應(yīng)用 GeoMx DSP 進(jìn)行無偏全轉(zhuǎn)錄組空間圖譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者之間有 2412 個(gè)基因存在差異表達(dá)，通路富集顯示與細(xì)胞 - 細(xì)胞、細(xì)胞 - ECM 粘附等相關(guān)的基因組得到富集，揭示了Tumour相關(guān)血管的分子特征和信號(hào)通路，為 TNBC 預(yù)后和抗血管生成治療潛在靶點(diǎn)研究提供了基礎(chǔ)。

·       GeoMx DSP 數(shù)字空間多組學(xué)分析系統(tǒng)基于 NanoString 的 nCounter 條碼技術(shù)，依靠與光可裂解寡核苷酸標(biāo)簽偶聯(lián)的抗體或 RNA 探針進(jìn)行檢測(cè)。其具體檢測(cè)原理如下：

·       探針設(shè)計(jì)：

·       對(duì)于 RNA 檢測(cè)，探針由探針序列、索引序列和 UV 連接點(diǎn)三部分組成。探針序列可與目標(biāo) mRNA 互補(bǔ)結(jié)合；索引序列包含正向和反向 PCR 引物結(jié)合位點(diǎn)，用于 NGS 建庫(kù)過程中的序列擴(kuò)增和接頭連接，還包含用于探針豐度定量的 14nt UMI 序列和用于鑒定探針對(duì)應(yīng)基因的 12nt probe ID；UV 連接點(diǎn)連接探針序列和索引序列，可在紫外照射下斷開。

·       對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)，將探針序列替換為抗體，通過抗體識(shí)別和靶向蛋白，再依靠索引序列完成定量。

·       雜交與標(biāo)記：將組織樣本貼片后，利用帶有光可裂解寡核苷酸標(biāo)簽的探針 / 抗體和免疫熒光標(biāo)記抗體對(duì)樣本進(jìn)行孵育，使探針 / 抗體與組織中的目標(biāo) RNA 或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，同時(shí)免疫熒光標(biāo)記抗體用于顯示組織的形態(tài)學(xué)特征。

·       感興趣區(qū)域選擇：通過顯微掃描獲取熒光標(biāo)記圖像，根據(jù)組織形態(tài)或研究需求，使用軟件以多種方式（如幾何形狀、細(xì)胞類型特異性、輪廓等）圈選感興趣的區(qū)域（ROI），ROI 大小可低至單細(xì)胞水平。

·       標(biāo)簽釋放：對(duì)選定的 ROI 進(jìn)行紫外光照射，切斷 UV 連接點(diǎn)，使寡核苷酸標(biāo)簽從探針 / 抗體上釋放出來。

·       定量分析：釋放的標(biāo)簽可通過兩種方式進(jìn)行定量。一種是利用 nCounter 系統(tǒng)，將熒光信號(hào)和索引序列直接雜交，通過熒光信號(hào)順序確定索引序列對(duì)應(yīng)的基因 / 蛋白信息，直接計(jì)數(shù)熒光信號(hào)作為表達(dá)量定量結(jié)果，此方法更適合蛋白組定量；另一種是采用 NGS 測(cè)序，將索引序列用于文庫(kù)構(gòu)建，通過與 probe ID 庫(kù)比對(duì)和 UMI 來完成對(duì)基因的定量，更適合全轉(zhuǎn)錄組定量。最后，根據(jù)標(biāo)簽的計(jì)數(shù)和其對(duì)應(yīng)的空間信息，生成分析物豐度的空間分辨數(shù)字圖譜，從而得出目標(biāo)分子在組織特定區(qū)域的表達(dá)情況。

與其他組織分析系統(tǒng)相比，GeoMx DSP 具有分辨率高、檢測(cè)通量高、樣本兼容性好等優(yōu)勢(shì)，具體如下：

·       高分辨率空間分析：可提供細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的高分辨率空間信息，能幫助研究人員清晰了解不同細(xì)胞類型之間的功能組織和相互作用，這是許多其他組織分析系統(tǒng)難以達(dá)到的。

·       靶向精準(zhǔn)分析：最大特色在于 “靶向性”。它融合多重免疫熒光技術(shù)，通過對(duì)切片的多重免疫熒光染色了解形態(tài)學(xué)特征，用戶可根據(jù)研究目的針對(duì)性圈選目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析，有效規(guī)避全切片無差別檢測(cè)帶來的數(shù)據(jù)挖掘壓力。

·       檢測(cè)通量高：支持 multiplexed analysis，可同時(shí)測(cè)量多達(dá) 21,000 多個(gè) RNA 靶點(diǎn)，還能在一張組織切片上實(shí)現(xiàn)多達(dá)上百種蛋白質(zhì)的原位共分析，能在同一樣本上進(jìn)行多次檢測(cè)，大幅提高檢測(cè)效率。

·       樣本兼容性好：可適用于各種類型的組織樣本，包括固定的、冷凍的、甚至是全切片的樣本，還兼容 FFPE 石蠟包埋樣品，也適用于多種物種的樣本，對(duì)珍貴樣本可進(jìn)行非破壞性處理，且樣本可重復(fù)使用。

·       靈活性與定制性強(qiáng)：研究人員可設(shè)計(jì)定制化面板，靶向特定基因或通路，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適當(dāng)?shù)奶结槨⑿酒头治龇椒?，以滿足各種研究需求。

·       靈敏度和重復(fù)性高：基于探針的化學(xué)方法使其具有五對(duì)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍，能檢測(cè)低、中、高表達(dá)水平的基因，可檢測(cè)到低表達(dá)水平的基因并能檢測(cè)出微小的表達(dá)變化，重復(fù)性超過 92%，結(jié)果可靠，適合大規(guī)模隊(duì)列研究。

以下是一些使用 GeoMx DSP 數(shù)字空間多組學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行研究的文獻(xiàn)資料：

·       《Spatial Transcriptome-Wide Profiling of Small Cell Lung Cancer Reveals Intra-Tumoral Molecular and Subtype Heterogeneity》3：2024 年 6 月 19 日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院Tumour醫(yī)院楊琳 / 劉雨桃和溫州醫(yī)科大學(xué)周猛研究員課題組在《Advanced Science》雜志上發(fā)表了該論文。研究利用 GeoMx DSP 技術(shù)對(duì) 25 例小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者的 79 個(gè)Tumour特異性區(qū)域進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了Tumour內(nèi)部的多區(qū)域異質(zhì)性，開發(fā)了 ITHtyper 機(jī)器學(xué)習(xí)模型用于異質(zhì)性分類和風(fēng)險(xiǎn)分層，為 SCLC 重新分類和個(gè)性化治療方案開發(fā)提供了新視角。

·       《High multiplex analysis of the immune microenvironment in bone marrow trephine samples using GeoMX™ digital spatial profiling》：發(fā)表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》，研究探討了 GeoMx DSP 技術(shù)在分析骨髓活檢樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)的適用性。通過對(duì)正常、骨髓增生異常和再生障礙性貧血患者的骨髓活檢樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)骨髓免疫微環(huán)境的高多重分析，有助于血液惡性Tumour相關(guān)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制研究。

·       《樂備實(shí)推薦 | 空間多組學(xué)在Tumour發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用案例匯總》1：該文獻(xiàn)（來源于搜狐網(wǎng)）介紹了多個(gè)利用 GeoMx DSP 技術(shù)研究Tumour的案例。如通過分析 8 例 pT1 結(jié)直腸癌患者樣本，剖析了結(jié)直腸癌惡性轉(zhuǎn)化過程中的轉(zhuǎn)錄組和免疫學(xué)變化；對(duì)正常上皮、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變等不同階段的食管鱗癌組織研究，證實(shí)了 TAGLN2 及 CRNN 為食管鱗狀癌前病變發(fā)展為 ESCC 的風(fēng)險(xiǎn)候選生物標(biāo)志物；對(duì) 10 例早期肺腺癌患者樣本分析，揭示了肺腺癌Tumour內(nèi)空間異質(zhì)性等。