NeruoPrime Cerebral inducer Kit

NeruoPrime series 全腦類器官誘導(dǎo)試劑盒

1、 產(chǎn)品描述

NeruoPrime series 全腦類器官誘導(dǎo)試劑盒是?；镆陨窠?jīng)外胚層自分化體系為研發(fā)基礎(chǔ)的一款腦區(qū)不定向分化試劑盒，通過四種組分完成經(jīng)典的腦類器官分化流程即:神經(jīng)外胚層分化、神經(jīng)上皮出芽及神經(jīng)管形成、神經(jīng)擴(kuò)張、腦成熟。誘導(dǎo)過程需要植入EB球于低生子因子基質(zhì)膠(貨號(hào):082703)，誘導(dǎo)38天以上的全腦類器官表達(dá)TUJ1、SOX2、Nestin、NeuN等基礎(chǔ)神經(jīng)表征、FOGX1、CTIP2等前腦、皮層表征,進(jìn)入長期培養(yǎng)后≥80天可少量表達(dá)GFAP、TH等功能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞Maker。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 ?；锿扑]用細(xì)胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手須知

NeruoPrime series 腦類器官誘導(dǎo)試劑盒理論上可以形成至少98個(gè)腦類器官，但是建議每次誘導(dǎo)以1/2個(gè)六孔板啟動(dòng)分化流程，形成至少98個(gè)均一大小EB球進(jìn)行全腦誘導(dǎo)流程。

注意事項(xiàng)：在使用時(shí)應(yīng)始終穿戴，在處理諸如人體細(xì)胞或其他生物及有害物質(zhì)時(shí)應(yīng)遵循安全的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程。

僅用于科學(xué)研究。

6、 使用說明

a)     實(shí)驗(yàn)用品

低生長因子基質(zhì)膠、StemGrowth series 多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、StemGrowth series EBs形成培養(yǎng)基、全腦類器官誘導(dǎo)試劑盒、超低黏附96孔u底板/超低黏附6孔培養(yǎng)皿

b)      使用程序：

b.1、PSC細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)上皮干細(xì)胞NESC的二維誘導(dǎo)

1、   根據(jù)不同PSC細(xì)胞系的特性從ESC＜60P、iPSC＜50P中復(fù)蘇一支細(xì)胞、經(jīng)過兩次高質(zhì)量傳代記作復(fù)蘇后P3（干細(xì)胞培養(yǎng)操作見StemGrowth series多能干細(xì)胞培養(yǎng)基 /StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium培養(yǎng)SOP）

2、   PSC傳代后細(xì)胞克隆密度達(dá)到80%, 10x顯微鏡下觀測(cè)克隆邊緣圓潤光滑、干性維持良好即可進(jìn)行EBs誘導(dǎo)，誘導(dǎo)克隆匯合時(shí)間計(jì)4-7天。

3、   對(duì)于3孔/6孔版 80 % 密度的PSC，準(zhǔn)備12mL的StemGrowth serie EBs形成培養(yǎng)基補(bǔ)充12μL的StemGrowth serie抗脅迫補(bǔ)充劑。準(zhǔn)備3mL StemGrowth serie水解酶溫和消化液添加3μL StemGrowth serie 抗脅迫補(bǔ)充劑、準(zhǔn)備50mL DPBS無菌不含鈣鎂，和10mL DMEM/F12預(yù)熱到室溫。

4、   使用不含鈣鎂的室溫 DPBS洗滌六孔板的三個(gè)孔一遍，棄掉DPBS，每孔加入1mL的StemGrowth serie水解酶溫和消化液37度消化7-10min。

5、   鏡下觀察細(xì)胞的消化情況、直到細(xì)胞邊緣變的透亮且連片飄起即可終止消化，每孔加入1mL的DMEM/F12中合消化液，吹打至細(xì)胞脫落且成單細(xì)胞型態(tài)，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞活力高于90%即可進(jìn)行下一步誘導(dǎo)。

6、   130g/ 3min離心收集到的6mL細(xì)胞懸浮液，棄掉上清加入12mL的StemGrowth series EBs形成培養(yǎng)基1x StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑,再次檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞計(jì)數(shù)，最終每mL的細(xì)胞量在50000-80000之間。

7、   準(zhǔn)備一個(gè)超低黏附的96孔u底板，將12mL的細(xì)胞懸液（含1x StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑)加入加樣槽中，使用排槍/移液槍每孔加入100μL的細(xì)胞懸液。加樣完成后將培養(yǎng)皿用封口膜封好使用水平板式離心機(jī)1200rpm/3min離心。

8、   撕掉封口膜放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜、第二天每孔加入100μL StemGrowth series EBs形成培養(yǎng)基不含 StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑。

9、   48小時(shí)后懸浮的細(xì)胞即可聚集成球，邊緣光滑圓潤的EBs狀態(tài)。

注意！PSC克隆出現(xiàn)問題、自分化及漂浮的情況應(yīng)再啟動(dòng)復(fù)蘇擴(kuò)增一株，不可直接用于誘導(dǎo)

b.2、神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)

1、   將誘導(dǎo)48小時(shí)的EBs轉(zhuǎn)移到超低黏附6孔板里，每孔加入10個(gè)EBs后使用DPBS洗滌一次清除上個(gè)階段的培養(yǎng)基殘留，吸棄DPBS后每孔加入2mL的神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每天2天換液一次，誘導(dǎo)共4天。

2、   出現(xiàn)神經(jīng)外胚層擴(kuò)張的EB邊緣變的透亮，直徑＞400μm，內(nèi)部致密無空腔，整體呈現(xiàn)類似小鼠原代神經(jīng)球的型態(tài)。

b.3、神經(jīng)出芽

1、   當(dāng)EBs直徑達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)400-600μm即可進(jìn)行基質(zhì)膠包埋，4度化凍分裝的低生長因子基質(zhì)膠（082703）2mL。

2、   準(zhǔn)備一張長寬均10cm的封口膜，在200μL槍頭盒上按壓出凹點(diǎn)，放置于10cm皿，使用酒精浸泡30秒后置于安全柜紫外烘干30min以上即可使用。

3、   使用寬口10-100μL移液槍頭(量程50μL)吸取神經(jīng)外胚層分化結(jié)束的EB與按壓的凹點(diǎn)上，一次建議操作10個(gè)為佳。之后使用移液槍小心的吸棄凹點(diǎn)內(nèi)的培養(yǎng)基殘留后，每個(gè)凹點(diǎn)及EBs加入30μL的低生長因子膠小心包埋EBs，如若EBs在膠體邊緣則使用10μL小槍頭輕輕挑弄EBs周圍的膠體讓其置于部位。(注意不要形成氣泡)

4、   將包埋好的EBs蓋好，放于37度凝膠15min后使用無菌的鑷子夾起封口膜，用1mL的神經(jīng)出芽培養(yǎng)基將每排的EBs膠體貼著凹點(diǎn)的底部吹到超低黏附六孔板中，每孔最多放置10個(gè)類器官，每孔培養(yǎng)基體積不能大于3mL。

5、   如若一次性制作太多EBs，也可以直接將預(yù)冷30min以上的12mL的神經(jīng)出芽培養(yǎng)基補(bǔ)充10%的低生長因子基質(zhì)膠（貨號(hào)：082703)，即1.2mL的膠體，漩渦混勻后。吸棄原孔板中的神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每孔補(bǔ)充3mL神經(jīng)出芽培養(yǎng)基+基質(zhì)膠，誘導(dǎo)48小時(shí)后吸棄培養(yǎng)基，使用DPBS洗滌兩次，再次加入3mL每孔不含基質(zhì)膠的神經(jīng)出芽培養(yǎng)基進(jìn)行第6步操作。

6、   將超低六孔板放置于水平搖床(80rpm/s)里37度培養(yǎng)18天完成神經(jīng)上皮的擴(kuò)張，每兩天換液一次。EBs一般在神經(jīng)上皮擴(kuò)張第4天的時(shí)候出現(xiàn)早期VZ、SVZ樣的結(jié)構(gòu)、12天后芽點(diǎn)慢慢匯合變黑。

b.4、神經(jīng)及腦成熟

當(dāng)EBs中心致密、外層形成疏松的上皮結(jié)構(gòu)且直徑大于1mm說明神經(jīng)擴(kuò)張到成熟階段，棄去神經(jīng)出芽培養(yǎng)基，每孔加入3mL的神經(jīng)成熟培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)至38天后(每兩天換液一次/80rpm/s)，EBs的直徑大于2mm時(shí)內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)無法滲入的情況，需要使用1mL注射器將EBs周圍的膠體小心的去掉后每孔加入3mL腦成熟長期培養(yǎng)基(每天換液)，并提高搖床轉(zhuǎn)速至120rpm/s改善營養(yǎng)循環(huán)狀態(tài)，讓腦類器官可以長期培養(yǎng)＞100天。

V1.1版

更新時(shí)間：2025/06/23