Mouse Intestine Organoid Kit Plus

小鼠小腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus

1、 產(chǎn)品描述

?；镄∈笮∧c類器官培養(yǎng)基套裝Plus（Mouse Intestine Organoid Kit Plus）是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細胞來源的小腸類器官培養(yǎng)基套裝?？奢^大程度維持小腸隱窩的活性，并提升小腸類器官的形成率，所培養(yǎng)的小鼠小腸類器官主要由小腸干細胞、快速擴增細胞、腸吸收細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官能部分重現(xiàn)小鼠腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備試劑和耗材

4、 小鼠小腸類器官培養(yǎng)基使用說明

1、   收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進行解凍。

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進行分裝，推薦分裝成10mL/管。

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 小鼠小腸類器官的建立與傳代培養(yǎng)

a)     原代小鼠小腸類器官的建立

1、   實驗前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。

2、   取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近胃端3~10cm小腸組織，用鑷子去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含雙抗的DPBS溶液中。

3、   清洗：使用將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用夾住腸組織一端，另一只手使用片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗2次。將清洗后的小腸碎至5mm寬，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用DPBS清洗2遍。

4、   消化：將清洗好的腸段轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入30mL的DPBS溶液中再加入300μL 0.5M EDTA，至EDTA終濃度為5mM。置4℃搖床上，80rpm，消化30min。

5、   消化結(jié)束后，待腸段沉降離心管底部，吸棄上清，加入5mLDPBS，使用寬口移液管吹打腸段，肉眼觀察到大量的絨毛脫落，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現(xiàn)完整隱窩即可終止消化，若無隱窩添加EDTA至終濃度為5mM適當延長消化時間。

6、   清洗：消化完成后，靜置待腸段沉淀，棄上清。加入預冷DPBS，輕柔搖勻，靜置后棄上清，重復2次以去除EDTA。

7、   重懸：加入30mL預冷的含0.1%BSA的DPBS，渦旋10s，取上清70μm濾網(wǎng)過濾，收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液。若需要大量培養(yǎng)可重復收集2次。

8、   收集：300g離心力4℃離心3min。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于含0.1%BSA的DPBS中，取懸液進行隱窩計數(shù)。

10、 300g離心力4℃離心3min，吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻

注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)，混勻后置于冰上。

注意：基質(zhì)膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約70個隱窩應接種在10μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進行種板，因為基質(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)。理想情況下，小鼠小腸類器官應在5至7天內(nèi)建成。

b)      小鼠結(jié)腸類器官的傳代培養(yǎng)

1、   待類器官培養(yǎng)到直徑為600μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約5天）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用。

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎培養(yǎng)基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   棄上清，加入1mL基礎培養(yǎng)基再次吹打類器官5~10次，取少量懸液鏡檢觀察類器官狀態(tài)：

3.1)若類器官已分散成碎片則可選擇機械吹打分散類器官后直接300g離心3min，離心后上皮類器官基礎培養(yǎng)基清洗2次。

3.2)若類器官比較完整可300g離心3min后，去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化2分鐘。消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎培養(yǎng)基輕柔吹打混勻以終止消化反應，然后300g離心3分鐘。

4、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

5、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養(yǎng)，在細胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

6、   將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。大約30個類器官團塊接種在10μL基質(zhì)膠中。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

7、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

8、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

9、   將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

10、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

11、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，直到類器官需要進行下一步實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/20