間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

MSC NutriStem^® XF Medium

以色列BI（Sartorius）MSC無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品說明書：

一、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

二、材料：新生兒臍帶

三、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜，CO₂培養(yǎng)箱，6孔培養(yǎng)板，T25培養(yǎng)瓶

四、試劑：

表1 MSC NutriStem^® XF Medium

五、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

5.1培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

5.1.1凍存的MSC NutriStem^® XF Supplement在室溫或2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融。

5.1.2配制：MSC NutriStem^® XF Basal Medium（培養(yǎng)基）：MSC NutriStem^® XF Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周內(nèi)使用。

注1：雙抗非必須，建議原代（P0）時(shí)使用。

注2：培養(yǎng)基含L-Glutamine，貯藏時(shí)避免長(zhǎng)期照光。

5.2包被培養(yǎng)皿

或跳過此步驟，直接加2%血小板裂解物，促進(jìn)MSC細(xì)胞貼壁與生長(zhǎng)。

如果使用05-752-1H，參考如下步驟：

5.2.1使用DPBS溶液（BI, Cat# 02-023-1A），將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。

5.2.2參照表3，加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。

表3  涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-752-1）

注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)試后可減半使用）

注2：包被期間， 注意包被液不可以干掉！

5.2.3輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

5.2.4在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育30分鐘。

5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。

如果使用05-760-1-15，參考如下步驟：
5.2.1使用生理鹽水，將NutriCoat™ 促貼壁試劑稀釋500倍（1:500）。
5.2.2參照表4，加入適量的1X NutriCoat™ 促貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。

表4  涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-760-1-15）

注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。

注2：包被期間，注意包被液不可以干掉！

5.2.3輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。
5.2.4在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育1小時(shí)。

5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿（或不需要清洗），即可接種細(xì)胞。

5.3制備1X大豆抑制劑

5.3.1使用無菌的DPBS，將50X大豆抑制劑（03-048-1C）稀釋成1X。

注1：抑制重組消化建議方法：第一種使用大豆抑制劑；第二種使用PBS/DPBS清洗（2倍重組量）吹打, 離心去上清；第三種使用維持培養(yǎng)基抑制。

六、使用范例：

6.1 UC-MSC原代培養(yǎng) （組織塊法）

6.1.1無菌條件下取新鮮臍帶，用DPBS漂洗凈血跡

注1： 一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用75%酒精潤洗。

6.1.2置10cm 培養(yǎng)皿中，剪成1~2cm臍段，剔除血管，用DPBS洗凈血跡，再剪成1mm³組織塊。(圖 1)

6.1.3用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個(gè)孔中。

6.1.4 37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。

6.1.5 向每孔滴加0.8ml 培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊)。

6.1.6 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱孵育過夜，次日 (D1) 每孔再補(bǔ)加1ml 培養(yǎng)基。

6.1.7 37℃，5% CO₂ 繼續(xù)培養(yǎng)，5天 (D6) 后半量換液 (此時(shí)一般看不到細(xì)胞，但最快3天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出)。

6.1.8再過5天后半量換液 (此時(shí)一般會(huì)有細(xì)胞爬出，但最晚可到14天會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖2、圖3)。

6.1.9每2天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2~4天，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約80%后傳代培養(yǎng)(圖4)。

注1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動(dòng)作要盡可能輕微，避免沖動(dòng)組織塊。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮。

注2：為增加成功率，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)基可加2.0 % PLTGold® 血小板裂解物。

6.2 UC-MSC原代培養(yǎng) （消化法）

MSC NutriStem^® 無血清培養(yǎng)基也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞，操做方式如下：

6.2.1 將臍帶用DPBS漂洗干凈，剪成1-50px,后剔除血管。

注1：一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用75%酒精潤洗。

6.2.2剪成3-5mm³后，移入50ml離心管，再加入的分離液。

注1：一條長(zhǎng)度10公分的臍帶建議加入10ml的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1。

注2： 視情況而定，可自行在分離液中添加1%青鏈雙抗（BI, Cat# 03-031-1B）。

6.2.3把50ml離心管橫放在37度細(xì)胞培養(yǎng)箱，過夜反應(yīng)（16小時(shí)）。

注1：若總反應(yīng)體積較大，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合。

6.2.4加入和分離液等體積的0.05?TA（BI, Cat#03-015-1B）終止反應(yīng)后，1500 xg離心5分鐘，去除上清。

注1：溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下5ml左右的溶液。

注2： 若是脂肪組織，沒有粘稠的情形，以常規(guī)的200-300 xg離心即可。

注3：沒有EDTA, 可使用無鈣鎂DPBS取代；此時(shí)建議后面步驟6多重復(fù)2-3次，以確實(shí)去除酵素。

6.2.5以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，500 xg離心5分鐘，去除上清。

6.2.6再次以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，250 xg離心5分鐘，去除上清。

6.2.7用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種P0代細(xì)胞培養(yǎng)。

注1：消化后的原代細(xì)胞，建議培養(yǎng)時(shí)接種密度提高到10,000/cm²以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng)。

6.3 UC-MSC傳代培養(yǎng)與凍存

6.3.1待細(xì)胞融和度達(dá)到約80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基，每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次。

6.3.2根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重-EDTA（貨號(hào)：03-079-1A，T25建議使用1ml），在37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱作用3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）。

6.3.3顯微鏡下觀察細(xì)胞脫落后，使用5-10ml稀釋大豆抑制劑（SBTI, 貨號(hào)：03-048-1，1X），1000rpm離心3~5min。

6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。

6.3.5按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照5000-6000cells/cm²的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入37℃, 5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

6.3.6每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，參照操作步驟6.3.1~6.3.5做細(xì)胞傳代；或者參照操作步驟6.3.1~6.3.3收獲細(xì)胞凍存。

6.3.7細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量 (0.5~1×10⁶cells/ml) D10無血清 凍存液（貨號(hào)：05-713-1）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置 24h，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。

注1：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)做合理調(diào)整。

附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）

 圖1剔除臍帶3根動(dòng)靜脈血管            圖2細(xì)胞從組織塊邊沿爬出

圖3細(xì)胞快速增殖                            圖4傳代時(shí)機(jī)成熟