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實驗室的PCR污染問題如何處理

來源:北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司 2017年09月28日 10:19

生物實驗,大多數(shù)實驗檢測都是微觀的,基于細(xì)胞,分子,蛋白水平,而這些微觀樣本對外界環(huán)境的影響敏感,比如溫度、ph值、酶解、損傷等,在我們盡力呵護(hù)樣本的生存環(huán)境的同時,污染也是需要注意的頭等大事,要堅決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入,包括樣本污染,試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對實驗結(jié)果的影響。“易查不易察”,污染來的悄無聲息,防不勝防,假陽性結(jié)果讓無數(shù)生物學(xué)子抓狂和崩潰。

在眾多的生物實驗室,分子生物學(xué)檢測方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,不過正是由于它靈敏度*,極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性,所以對環(huán)境污染的控制也極為嚴(yán)格。面對眾多的污染源,比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染,氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系,在空氣與液體面摩擦?xí)r,比如在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆??珊?8000拷貝,因而由其造成的污染是一個非常重要而被忽視的污染源。

雖然這些污染對PCR實驗結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視,多數(shù)實驗室對污染控制都采取了各種辦法,比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹(jǐn)慎、重復(fù)實驗、多角度驗證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴(kuò)增,所以對污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的,關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗室,分子實驗每天都在大規(guī)模進(jìn)行,污染源已經(jīng)無處不在,特異性的,非特異性的,同源的,非同源的,廣泛分布在樣本容器、實驗室臺面,試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等,你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎?必須是不行的,實驗室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法,整理跟大家共享。

傳統(tǒng)方式

原理

優(yōu)勢

不足

酒精擦拭

將核酸沉淀,擦拭后保證污染表面污染得到一定程度緩解

簡單、方便、成本低

不*(核酸片段本身沒有變化,仍然存在導(dǎo)致氣溶膠污染的可能性)、細(xì)小孔徑器材無法清除

修飾

標(biāo)記遺傳物質(zhì),阻止聚合酶與核酸的結(jié)合,從而抑制DNA擴(kuò)增

效果相對好

反應(yīng)可逆、成本高、試劑可能具有不安全影響

酶解

酶可將長鏈的核酸分子降解成小片段

速度快,效果相對較好

降解的核酸中仍有大片段存在,具有完整的遺傳信息,可通過PCR擴(kuò)增出完整的片段、成本高

高壓變性

高壓可將核酸降解成20~30bp的小片段

*,成本低

僅適用于耐高壓材料,更無法應(yīng)用實驗操作臺和大型的實驗設(shè)備

紫外照射

PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體,延伸終止

方便,范圍廣,成本低

僅對500bp以上長片段有效,對短片段效果不大,且并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂

縱然有這么多解決核酸污染源的辦法,但是大多數(shù)實驗室卻由于使用不方便、操作復(fù)雜、成本高、危害大而沒有持續(xù)采用,實驗室累積的污染也就越來越多,有些實驗者甚在ddH2O中擴(kuò)增出了條帶,結(jié)果可重復(fù)性差、投稿文章被質(zhì)疑,不得不重新實驗,當(dāng)然在實驗之前,必須要*清除這些污染源,這么嚴(yán)重的污染如何的清除,是一個迫在眉睫的問題。目前國外學(xué)者經(jīng)過不斷研發(fā)拓展,有一款清除劑DNA-ExitusPlus已經(jīng)問世,并得到了Nature Methods的推薦,此款清除劑純綠色配方,能夠?qū)⑽廴驹吹暮怂崞?降解成核苷酸為單位的極小片段,此過程不可逆,避免了污染重復(fù)的可能性,使用方便,使用與所有臺面,儀器擦拭,小部件浸泡等,無污染,無腐蝕性,對人體無危害。簡直是廣大核酸污染受害者的福音啊。

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