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產(chǎn)品貨號：D0204P

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡介

基于重組原理的無縫克隆技術，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。

DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最kuai僅需5分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。Mix中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chǎn)物中含有的雜質。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

使用簡單 —— 兼容PCR與酶切體系，省去繁瑣的純化步驟

超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系

穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次，無明顯下降

實驗步驟

1、實驗流程概要

2、線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴增完成。

① 酶切制備

推薦使用LabFD™快速內(nèi)切酶進行雙酶切，使載體線性化*，以降低轉化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切進行線性化，可以適當延長酶切時間以減少環(huán)狀質粒殘留。

注1：經(jīng)雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；

注2：酶切完成后，應將快速內(nèi)切酶失活或對目的產(chǎn)物純化后再用于重組反應。

② 反向 PCR 擴增制備

為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix進行擴增。推薦使用預線性化質粒作為模板，以減少環(huán)狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

3、插入片段PCR引物設計

PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列。假如載體為粘性末端，且3'端突出，則引物設計必須包含突出部分；若5'端突出，則引物設計可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向擴增引物：

5'—上游載體末端同源序列+酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'

插入片段反向擴增引物：

3'—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆，當載體克隆位點上下游25 nt區(qū)域內(nèi)GC含量為40%~60%時，重組效率zuigao；

注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4、插入片段的 PCR 擴增

推薦使用高保真PCR Mix進行擴增，以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進行無縫克隆反應，若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應超過總反應體積的20%。

5、重組反應

①于冰水浴中配置以下反應體系：

a.the best載體用量(ng)=0.02×載體堿基對數(shù)，即0.03pmol。

b.插入單片段，the best片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數(shù)；

插入多片段，每片段the best用量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù)。

注1：若插入單片段的長度大于載體，則應互換載體與插入片段用量；

注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應使用5倍載體用量；

注3：若按上述公式計算得到的用量超過最di/最gao值，則建議直接按最di/最gao用量使用；

注4：載體片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會降低。

重組反應體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。

② 將反應體系置于50℃，反應5~60min。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準的儀器進行反應，反應時間不足或太長克隆效率均會降低；

注2：插入1-2個片段時，推薦反應時間5-15min，插入3-5個片段時，推薦反應時間15-30min；

注3：當載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時，建議延長反應時間到30-60min

注4：50℃反應完成后，建議進行瞬時離心，將反應液收集至管底。

③ 將反應液離心管置于冰上冷卻，之后進行轉化或者儲存于-20℃。

注1：-20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在1周內(nèi)使用。

6、重組產(chǎn)物轉化

取5~10μl反應液，加入到100 μl感受態(tài)細胞中緩慢吸打混勻，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40~60min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。

注1：不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽性率會有所差別，推薦使用轉化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細胞；

注2：菌落數(shù)取決于PCR產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落。

7、陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作為模板，進行菌落PCR鑒定，或將單菌落接種至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質粒進行酶切鑒定。

注1：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結果；

注2：必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定。

常見問題